本发明公开了一种人表皮干细胞的分离方法。该方法包括如下步骤：(1)将离体的人的皮肤组织用DispaseⅡ进行处理；再用胰蛋白酶进行消化处理；(2)将消化处理后的体系静置，分别取沉淀和上清液；(3)将静置所得的上清液进行终止消化，离心，弃上清，取沉淀；对沉淀进行重悬，得到组织液1；(4)将静置所得的沉淀用胰蛋白酶进行消化处理后过滤；(5)将过滤所得的滤液进行终止消化，离心，弃上清，得到组织液2；(6)将组织液1和组织液2混合，得到组织液3，对组织液3进行重悬；(7)对组织液3中的细胞进行筛选，得到人表皮干细胞。本发明的方法具有温和、快速、高效分离表皮干细胞的特点。