本发明公开了一种人真皮干细胞的分离方法。该方法包括如下步骤(1)将离体的人的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；(2)将真皮部分和表皮部分撕开，并用Ⅰ型胶原酶工作液进行消化处理；(3)用Ⅰ型胶原酶工作液反复吹消化处理后的组织液，过滤；(4)将滤液进行离心，分别取沉淀和上清液；(5)将经步骤(4)所得的沉淀进行重悬，得到组织液1；(6)将经步骤(4)所得的上清液进行离心，弃上清，取沉淀，对所述沉淀进行重悬，得到组织液2；(7)将组织液1和组织液2混合，得到的组织液3；(8)对组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人真皮干细胞。本发明利用酶处理液代替常规酶液，有效的提高了真皮干细胞的分离效果。