本发明公开了一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法，首先利用中性蛋白酶分离毛囊的表皮部分和真皮部分，先利用I型胶原酶分离皮肤表、真皮层后拨出毛囊，再对毛囊进行胰蛋白酶消化处理，随即将毛囊培养于含有表皮生长因子、类胰岛素生长因子-I、氢化可的松和10％FBS的DMEM/F12培养液中，置5％CO2的37℃饱和湿度培养箱中进行培养。当培养板中的毛囊迁移出大量细胞时，换为含EGF、IGF-I和氢化可的松的无血清角质细胞培养液中启动原代培养。待原代毛囊干细胞生长至汇合时，进行传代，将稳定生长至3～5代的细胞更换含EGF、IGF-I、氢化可的松和2％FBS的DMEM/F12培养液中培养，以利于毛囊干细胞在体外长期传代培养。采用该方法本细胞系已经稳定传至5代以上，其生长分裂状态良好。