本发明公开了一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途，本发明所提供的方法包括：利用7天或2个月小鼠，分离睾丸，去除被膜和血管，暴露生精小管后用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液；通过CD51的细胞特异标记，利用流式细胞仪进行分选，获得单个细胞，收集表达CD51的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。本发明提供了根据上述方法分离的睾丸间质来源干细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖、具有多向分化潜能的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗睾酮水平低下导致的相关疾病的组合物的用途。