本发明提供一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，包括：将体细胞在细胞培养液A中培养1-3天；在细胞培养液B中继续培养1-6天；然后在细胞培养液C中继续培养1-6天；以及收集雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞；本发明还提供了一种用于制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的试剂盒。使用本发明的方法及试剂盒在非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的产量、纯度、生产速度方面具有显著优势。