本发明公开了分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。所述灌洗液包含青-链霉素双抗、酚妥拉明、维生素C和PBS。所述酶解液包含基础培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、1×肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z-VAD-FMK。所述方法用灌洗液灌注清洗预处理后的胎盘；将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置；松开胎盘动静脉并从动脉灌注灌洗液，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得胎盘造血干细胞。本发明显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量高、存活率高，细胞污染率极低。