本发明涉及一种乳牙牙髓在制备间充质干细胞的应用及乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，步骤如下：将乳牙经过原代培养获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液，再将乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液经传代培养即获得乳牙牙髓间充质干细胞。本发明采用了乳牙牙髓作为制备间充质干细胞的组织材料，这与骨髓、脐带血、胎盘不同，采集的方式为自然脱落或手术拔除的儿童完整乳牙。由于儿童有20颗乳牙，以上下颚各6颗乳牙培养出之乳牙干细胞最好，由于不必一出生就取样，而且还有20次采集的机会，所以即使错过胎盘和脐带组织采集机会的人，和目前已曾掉落来不及收集的儿童，20颗中的任何一颗乳牙，皆有机会获得乳牙间充质干细胞。