本发明提供了一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，属于生物技术领域，具体是取新鲜胎盘，用缓冲液洗去污物及血液；分离得到绒毛膜，使用缓冲液洗去绒毛膜中的红细胞；然后将绒毛膜剪碎，用PBS缓冲液进行重悬，然后加入红细胞裂解液，室温裂解3min；然后加入L-DMEM培养基洗涤，离心弃上清，在组织块沉淀中加入含10%-20%FBS的DMEM培养基混匀，接种至细胞培养皿中进行培养。本发明制备过程程序化，简化操作步骤，缩短操作时间，减少工作量，避免污染，减少试剂和耗材的使用量，同时增加了间充质干细胞的产量，所得细胞全部为单一来源的胎盘源胎儿间充质干细胞。