本发明涉及一种建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，属于动物细胞（组织）工程领域。胶原酶消化成年大鼠胰腺组织，Dextron不连续密度梯度离心，RPMI1640有血清培养，胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长，克隆环筛选，上皮样干细胞纯化，胰蛋白酶消化液消化传代，建立细胞系；采用该方法建立的一例大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的特征是细胞贴壁呈多角形上皮样，克隆性生长，是正常的二倍体细胞，在蛋白水平表达增殖细胞核抗原、八聚体转录因子4、干细胞关键蛋白、角蛋白19和神经源性分化因子2，具有多分化潜能，无致瘤性。