本发明涉及脐带全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状，消化处理1.5小时；配制脐带组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将脐带全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，复苏的脐带全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。