本发明公开了一种肿瘤干细胞的分离方法，该方法为将肿瘤细胞消化为单个细胞后，再加入消化酶液孵育数小时；将孵育后的细胞加入含血清的细胞培养液进行贴壁生长；细胞贴壁后换肿瘤干细胞TSC培养基进行培养；当细胞长满后，重复多次前述操作后，将获得的细胞进行微球培养，最终获得的微球即为肿瘤干细胞。本发明首次使用多种消化酶或者结合其他物理应激条件刺激多种肿瘤细胞，可以稳定地获得不同类型的TSC；本发明分离的MuseTSC拥有极强的肿瘤干性，均质性好，稳定，因此该方法的建立使获得不同类型的TSC得以标准化，并且更加简单经济，适合大规模构建TSC库所用，以满足常规肿瘤生物医学基础研究、临床研究以及药物开发等工作需求。