西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：包含以下步骤；（1）将西红柿的茎经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后切成1厘米长的茎段并从中间纵向剖开；（2）将上述处理后的茎段放置在含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养；（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次。该方法采用未分裂的形成层干细胞进行分离及培养西红柿干细胞，其形成层干细胞进行无限增殖，可有效扩大生产。