本发明涉及细胞工程领域，公开了一种体外培养间充质干细胞的方法。本发明所述方法采用1.073g/cm³Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液中于37℃、5%CO₂浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。本发明所述培养方法无需加入马血清、I-肌醇、L-谷氨酰胺、巯基乙醇等成分，成本低廉、配置简便，且细胞活力更高，细胞扩增所需的周期缩短，优于现有Dexter-LTC培养体系，能够为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。