本发明涉及一种来源于兽睾丸类胚胎干细胞的分离方法，属于干细胞生物工程。本发明公开的一种来源于兽睾丸类胚胎干细胞的分离方法，包括配制培养液、配制消化酶、兽睾丸类胚胎干细胞的分离三个步骤，所述配制的培养液由α-MEM、血清替代品、青霉素、链霉素组成。本发明使用的培养液成分简单，克隆形成效果好，解决了兽睾丸类胚胎干细胞的分离的问题。