本发明提供了一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，包括使用男性足月胎儿胎盘作为原料，无菌处理胎盘；分离蜕膜组织；鉴定蜕膜组织以及获取蜕膜间充质干细胞是否来自母体组织的鉴定；培养蜕膜间充质干细胞；蜕膜间充质干细胞的冻存；蜕膜间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术特点：采集胎儿为男性的胎盘，获得蜕膜组织后经性别鉴定是否来自母体而没有子体组织的污染；防范细菌污染方法，从采集源头减少污染几率，多次冲洗表面，有效减少污染几率；采用单一酶消化，可精简流程；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持蜕膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力等。