本发明公开了一种胚胎干细胞及其培养用饲养层细胞的制备方法。所述新型的小鼠胚胎干细胞及其培养用饲养层细胞的制备方法，饲养层细胞采用化学固定的方式制备。所述化学固定采用多聚甲醛（PA）作为固定剂。或者，所述化学固定采用戊二醛（GA）作为固定剂。整体培养过程包括如下步骤：（1）准备注射前将胚胎干细胞接种到饲养层细胞上，贴合度满足后进行一次传代；（2）注射前1天或注射当天将细胞用酶进行消化，然后离心收集细胞，吸出上清液后加培养基重悬；（3）冷藏或直接注射。进一步地，步骤（1）中贴合度为80%。相比于生物培养法，化学固定法能够提供质量稳定的ES细胞，可反复使用，而且饲养层细胞在消化处理时不会随着ES细胞脱落。