本发明提出了一种乳腺癌干细胞的分离方法，属于细胞的分离领域。它包括以下步骤：（1）制备胸水单细胞悬液；（2）免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞，得乳腺癌上皮细胞液；（3）采用非粘附培养法将步骤（2）得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球。与现有技术相比，本发明的有益效果是该分离方法所获得的细胞表面因不含有抗体和磁珠的干扰；而且可保证乳腺癌细胞的分离效率及其乳腺癌干细胞富集后的纯度；不仅能高效分离数量较少的乳腺癌上皮细胞，而且缩短了分离时间，降低了分离成本，安全有效。