本发明公开了一种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中消化18～20h后加入胰酶继续消化，然后进行过滤和离心，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞；将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞进行培养扩增。Ⅰ型胶原酶消化底蜕膜组织块时间较长，能够获取大量间充质干细胞，增大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间及培养周期，避免了细胞因多次复制引起的细胞质量下降以及功能形态变化，为临床使用胎盘底蜕膜间充质干细胞提供了良好的保障。