本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域。本发明的目的是提供一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，可通用于不同组织来源的肿瘤细胞的培养，而且该培养方法获得的肿瘤干细胞具有自我更新能力、且富集。本发明提供的一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，是将所需要培养的肿瘤细胞消化离心收集后，用PBS重悬离心，加入本发明制备的悬浮培养基中，吹打成单细胞悬液，再接种于铺制好的超低吸附培养皿中；进行细胞培养。本发明的方法体外培养各类肿瘤细胞的成球率高，表达多能性因子，OCT4、NANOG比例都有所增高，为肿瘤干细胞的研究提供了丰富而全面的实验材料，在基础研究及临床应用上都具有广泛的前景。