本发明公开了一种肺癌干细胞条件3D培养方法，属于细胞培养方法。本发明是将人肺腺癌细胞系A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，置于培养箱中培养，取对数生长期细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个细胞/ml，取200μL/孔加到已铺好50μL/孔BME的96孔板里；第3天，用含IGF-1和FGF的RPMI-1640完全培养基给A549细胞换液，继续培养；并经蛋白水解酶消化BME、回收液回收A549细胞，最后进行细胞鉴定。这样设计的本发明，A549细胞在体外形成类似体内肿瘤团块的克隆团，更加接近体内立体生长状态，从而实现干细胞的稳定分离、有效扩增。筛选出对抗癌药物抵抗的肿瘤干细胞。