本发明公开了富集干细胞的三步分离法，解决现有技术分选的精确性不高，分选的成本较高的问题。本发明包括以下步骤：（1）细胞的纯化：通过差时贴壁和差时硝化的方法对原始细胞群进行纯化处理；（2）细胞的分群：通过Percoll连续密度梯度离心的方法对纯化后的细胞进行分群处理；（3）细胞的富集：通过培养液对细分群后的细胞进行培养，从中挑选出形成最大克隆球的细胞，即为干细胞。本发明将干细胞的贴壁强度特征、密度大小特征、克隆形成特征联合起来进行分选，更加精确地富集了干细胞。