本发明公开了一种兔脂肪干细胞的分离培养方法。包括以下步骤：（（1）无菌获取兔脂肪组织；（2）制备脂肪小块组织；（3）采用胰蛋白酶对脂肪组织进行消化，分离得上层溶液及下层沉淀；（4）对上层溶液采用时间递减梯度方法进行消化；（5）收集脂肪干细胞，用脂肪干细胞培养液混匀，接种培养；（6）脂肪干细胞的体外培养；（7）检测、冻存。本发明解决了传统脂肪干细胞细胞分离方法中存在的组织消化不够彻底，细胞分离效率低的问题，优化了脂肪干细胞的分离方法，使脂肪组织消化的更彻底，提高了细胞分离效率，从而提供了更优质的脂肪干细胞来源。