本发明公开了一种牙周膜干细胞的培养方法。所述培养方法将牙周膜干细胞接种到水凝胶上，用含BMP-2的无血清培养基进行三维培养。三维培养接种用的牙周膜干细胞在二维培养时，使用含bFGF的无血清培养基进行培养。与现有技术相比，本发明中的细胞与水凝胶培养体系能够更好保持牙周膜干细胞的增殖及细胞活力；所使用的三维培养体系简单易行，同时保持了良好的干细胞特征。