本发明涉及生物技术领域，尤其是一种自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法。该方法包括如下步骤：步骤a：收集血液样品，步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，步骤c：单核细胞在单核细胞孵育液中孵育30-60分钟，步骤d：利用CD34抗体富集分离单核细胞成分中的造血干细胞，并回收CD34表达阴性的细胞组分，步骤e：使用包含Notch-1的化学成分确定的造血干细胞扩增培养基培养造血干细胞，并使用添加了ROCK抑制剂的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞。本发明能够从一份血液样品中同时获得高活性、能扩增的造血干细胞和间充质干细胞，从而充分利用资源，促进行业发展。