本发明涉及一种肝癌干细胞的分离方法，包括如下步骤：1)将肝癌细胞用DMEM高糖培育基进行培养；2)将步骤1得到的肝癌细胞培养液进行消化传代；3)取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞，用流式分选荧光抗体CD90和CD24进行标记，然后用流式细胞仪分选，CD90和CD24都标记上的CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞。本发明选取两种标志物进行联合检测，提高了肝癌干细胞的分离和鉴定的成功率。操作简单，可以快速、高效地分离出肝癌干细胞，提供了一种新的分离肝癌干细胞的方法，具有良好的应用前景。