本发明公开一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，按照如下步骤进行：（1）制备样品溶液：取适量样品，用有机溶剂溶解，配制成每1L含盐酸小檗碱1.0×10^-5-3.0×10^-4mol的样品溶液；所述样品为盐酸小檗碱与盐酸川芎嗪、延胡索乙素其中一种的混合物；（2）设定参数：将盐酸小檗碱分子印迹色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.1-1mL/min，检测波长345nm，柱温箱30±10℃；（3）分离：启动进样阀使流动相将样品溶液带入盐酸小檗碱分子印迹色谱柱中，实现盐酸小檗碱的分离。本发明灵敏度高、操作简单，不会对药物和保健品造成二次污染。