本发明公开了一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用。本发明建立了“一锅法”制备放射性碘标记生物分子的方法，利用易得、使用方便的炔或叠氮修饰的小分子与具有生物靶向功能的生物分子、及放射性碘偶联生成放射性碘标记生物分子—5-碘代-1,4二取代-1,2,3三唑化合物。本发明方法在有水有氧的开放体系下进行，且该方法具有操作简便、标记率、产物纯度高的优点。本发明方法制备的放射性碘标记生物分子可用作临床SPECT/CT和PET/CT的分子探针，该方法亦为临床SPECT/CT和PET/CT分子探针的合成提供了新的思路；I¹³¹标记的生物分子还可以用作肿瘤治疗药物。