本发明公开了一种犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用，所述犬细小病毒单域抗体具有SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，是以犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼，取外周血得到羊驼抗犬细小病毒血清；提取外周血中RNA，反转录生成cDNA；特异引物扩增纯化VHH片段；将VHH片段与噬菌粒载体连接并转化TG1，构建犬细小病毒单域抗体库；利用犬细小病毒结构蛋白VP2富集所述抗体库，导入表达菌株E.coil？HB2151，IPTG诱导具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH表达。本发明制备的犬细小病毒单域抗体检测活性15μg/ml，检测灵敏度250ng/ml，可作为药物应用于犬细小病毒病犬的治疗中。