本发明公开了含自由三磷酸基团的谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS）特异性siRNA（ppp-GLS）、制备方法及其应用。ppp-GLS的反义链和正义链序列5’端均为鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷的戊糖5’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。本发明ppp-GLS可在制备治疗肿瘤特别是神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝癌的药物中应用。