本发明涉及一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法，包括以下步骤：标准工作液的配制、蜂花粉的前处理方法和液相色谱-串联质谱法检测。本发明提供了一种高效、稳定、重复性好，准确的鉴别五种蜂花粉的方法，对于加强蜂花粉种类鉴别的研究，探索蜂花粉溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂花粉质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。