本发明公开了特异性识别B-Raf突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用，属于生物科学和药物载体领域。利用本发明的方法制备出的三种单克隆抗体分别可以特异性识别三种B-Raf？N581S，B-Raf？V600E和B-RafV600K突变蛋白。这三种单克隆抗体可以用于检测动物或者人体组织中的B-Raf蛋白是否含有N581S、V600E和V800K突变，能为临床上皮肤癌等多种癌症的诊断和治疗提供依据。