本发明提供了一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物及其应用，该特异性探针底物是具有C-4'羟基的二氢黄酮类化合物，其酶活测定的流程如下：选择补骨脂二氢黄酮甲醚的C-4’羟基-O-葡萄糖醛酸化代谢为探针反应，通过定量检测单位时间内补骨脂二氢黄酮甲醚的消除量或其葡萄糖醛酸化代谢产物的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中UGT1A1酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中UGT1A1酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中UGT1A1酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶UGT1A1处置药物能力的评估。