本发明公开了一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽及其应用，其序列的通式如下:C_n-Trp-Ile-Leu-(Ala)_a-(Gly)_b-X-Y，其中氨基酸全为L型氨基酸；X为阳离子寡肽部分；Y为蛋白转导结构域；C_n为碳原子个数为10～20的的脂肪酸链；a和b代表氨基酸的数目。本发明多肽序列N端修饰加上的脂肪酸长链可以增强自组装过程的疏水相互作用，促进自组装。发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，可用于研制新型纳米抗菌药物。本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽制备工艺简单可行、成本相对较低，其应用能丰富现有的抗菌药物种类。