本发明提供了一类葡萄糖醛酸转移酶UGT1A3的特异性探针底物及其应用，其中酶活测定的具体操作流程如下：选择具有16位羟基的蟾蜍甾烯类化合物作为高特异性探针底物，并借助UGT体外孵育体系开展特异性底物的UGT催化反应，通过定量检测单位时间内产物生成量或底物消除量来测定各生物样品及细胞中UGT1A3酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中UGT1A3酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中UGT1A3酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶UGT1A3处置药物能力的评估。