本发明提供一种人结直肠癌肿瘤干细胞系及其制备方法和应用，所述细胞系为保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C，所述细胞系的制备方法，包括以下步骤：1)分离原代结肠癌干细胞；2)原代结肠癌干细胞的体外培养；3)结肠癌干细胞的培养及鉴定；4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤1)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系所述细胞系的应用为其在制备用于诱导肿瘤形成的药物、用于肿瘤转移的药物和筛选抗肿瘤发生、抗肿瘤生长和抗肿瘤转移药物中的应用。