一种三维片层结构的二氧化硅球形微粒的制备方法，由配制3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液、配制草酸乙醇溶液、制备3-氨丙基三乙氧基硅烷草酸胺盐、制备有机无机复合二氧化硅球形微粒、制备三维片层结构的二氧化硅球形微粒步骤组成。本发明具有反应体系简单易行、反应条件温和、产率高、易于大规模生产等优点。采用本发明所制备的三维片层结构的二氧化硅球形微粒，具有明显的三维片层组织结构，平均直径为4～6μm，可用于吸附分离、药物包裹、药物缓释、药物传输等领域。