本发明公开了一种单通道双浓度梯度微流控芯片，包括侧通道、主通道以及位于侧通道和主通道之间的一层PDMS膜，所述侧通道为化学吸氧反应通道，其两端分别为反应物入口和出口，所述反应物入口和出口之间依次设有混合区和反应区域，所述主通道为细胞培养通道，所述主通道的两端分别为入口和出口，氧气梯度和药物浓度梯度在主通道上形成。本发明还公开了上述芯片的制备方法和使用方法，建立了一个氧气浓度和化学药物浓度的双重梯度模型，应用于肿瘤细胞药物筛选。