本发明公开了一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用。一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，其制备步骤是：（1）JEV病毒SA14株基因序列的分段合成；（2）JEV病毒感染性克隆的组装与构建；（3）带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆的构建。本发明通过免疫荧光、Rluc活性的检测、病毒噬斑、药物抑制、活体动物成像及疫苗评价等实验证明：本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆可以拯救出具有与JEV病毒生长趋势相同的Rluc-JEV报告病毒，并且在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、活体动物成像及疫苗评价等方面具有广泛的应用价值。