本发明公开了一种利用活性污泥制备生物柴油的方法，步骤包括脱水、破壁处理、油脂提取、甲酯化及萃取。活性污泥经脱水后，用盐酸法或超声法进行破壁处理，释放胞内脂质，再以体积比为2∶1的二氯甲烷-甲醇溶剂提取油脂，并水浴蒸干油脂，接着以酸为催化剂进行油脂甲酯化反应，最后采用正己烷萃取脂肪酸甲酯。本发明将微生物破壁后提取油脂并干化，然后进行甲酯化，使普通酸催化酯化反应由5h缩短至1.5h，提高了反应速率以及脂肪酸甲酯产量。从活性污泥制备生物柴油的整个过程看，反应条件温和，利于操作。本发明以活性污泥为原料，优化了生物柴油制备方案，提高产量、降低成本，并且有利于实现污水处理厂剩余污泥资源化。