本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种利用城市生活污水厂剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，包括以下步骤：(1)取污水处理厂剩余污泥，进行超声预处理，随后进行固液分离得到澄清的污泥提取液；(2)污泥提取液经过pH调整及投加额外碳源后，形成完整培养基，灭菌后，接种生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液，发酵培养，即得到生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1。与现有技术相比，本发明使用污泥提取液作为生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1的发酵生产，能够降低其成产成本，且相比无机盐培养基培养，能够有效提高菌体产量，缩短发酵时间，同时获得的菌体破乳性能保持在较高水平，有利于生物破乳剂的推广应用，同时能够为剩余污泥减量及资源化提供新的途径。