本发明公开了一种创制结缕草高频再生系的方法。本发明提供一种创制结缕草高频再生系的方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草高频再生系。本发明的实验证明，本发明提供了一种创制结缕草高频再生愈伤组织系或再生植株及专用培养基，本发明通过筛选日本结缕草品种，以单粒种子为外植体，分别诱导出不同的愈伤系，经培养基配比组合和多次干化继代培养，筛选出分化能力强的愈伤系，每一系增殖的大量高频再生愈伤组织均为同质。最终，建立一种创制结缕草高频再生系的方法，为提高结缕草组织培养再生率和遗传转化效率提供实用方法。