本发明公开了苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因及其应用。一种苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长为1907bp，G＋C含量为55.37%，大亚基编码459个氨基酸，小亚基编码176个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明提供的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶PudmA能够把异丙隆和绿麦隆等苯基脲类除草剂的N-甲基脱除，使其失去除草活性。因此苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA可用于构建抗苯基脲类除草剂的转基因作物。此外苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA及其编码的蛋白质PudmA也可以用于消除环境中残留的苯基脲类除草剂。