本发明公开了一种获得三叶木通无菌苗的方法，该方法主要用三叶木通未成熟种子通过组织培养得到无菌苗，且先对果实进行灭菌处理，然后从灭菌处理过的果实中取出种子再次进行灭菌处理，将灭菌处理过的种子接种于培养基中，然后在组培室培养，培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA＋0.1g/L活性炭。采用本发明可大量获得三叶木通无菌苗，可克服外植体在得到无菌苗过程中染菌率大的问题，可大大缩短出苗时间，提高出苗率，并且节约成本和时间，提高了经济效益；所培育出的无菌苗可作为植物生物技术的材料。此外，本发明中采用种子做组培材料，具有材料多、繁殖快速的特点。