本发明涉及一种慈姑原生质体的制备方法。本发明将慈姑经过慈姑茎尖培养、试管苗水培预处理、原生质体的酶解、原生质体的纯化、原生质体的悬浮得到慈姑原生质体。本发明克服了现有慈姑的常规育种非常困难，易造成栽培品种遗传基础单一，阻碍慈姑品种改良等缺陷。本发明利用了茎尖组织培养技术获得了无菌的慈姑壮苗，为原生质体的分离提供了最佳的外植体，其次采用酶解法分离出高质量的慈姑原生质体，且其产量在2×10⁶个/克以上，活力超过80％，绝大多数为球形的，其细胞膜完整且富含叶绿体，具有较高活力，能满足后续各种研究需要。