本发明公开了一种大木枣叶柄多倍体诱导方法，包括以下步骤：①将大木枣无根试管苗接种在枣树生长培养基上，在散光照射下先培养7d，然后在光照14h/d、光照强度为1500lx±200lx、相对湿度70％±5％的条件下培养25d；②取其顶端向下完全展开的三片带叶柄的叶子接种在含秋水仙碱10-50mg/L的枣树生长培养基中；于培养10d-30d后转移到不含秋水仙碱的枣树生长培养基上，等待形成新的芽体；③等新芽体形成后按照单个芽体接种在原枣树生长培养基上。本发明以大木枣叶柄为外植体，利用组织培养和秋水仙碱诱变相结合的方式，来诱导染色体加倍，同时一步分化获得大木枣是四倍体植株。