本发明公开了一种抑制烟草愈伤组织继代过程中褐化的方法，其步骤：A、选取烟草种子萌发出的子叶为组织培养的外植体；B、通过平衡灭菌前培养基pH值和琼脂含量使培养基达到适合愈伤组织生长的最佳凝固效果；C、铁盐与微量元素分开灭菌；D、在培养基中加入0.5g/LPVP，并使培养箱湿度控制在18%-20%。该方法简单易行，操作方便，有效抑制了烟草愈伤组织继代过程中的褐变，效果好，烟草愈伤组织增殖系数可达到11.29(倍)；另外，该发明为烟草愈伤组织悬浮培养提供了优良的细胞种源。该方法培养的烟草愈伤组织松软，为获得分散均匀的悬浮细胞系提供了良好的条件。