本发明提供了用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法及其组合物。本发明还提供了具有所述变体识别位点的核酸构建体、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。本发明提供了鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的具有提高的底物活性的变体识别位点的方法。