本发明涉及一种石油降解酶制剂的制备方法与应用，制备步骤如下：将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液，然后粗酶液与载体混合吸附后，经分离、干燥，制得石油降解酶制剂；所述的降解石油的微生物为醋酸钙不动杆菌，菌种保藏号：CGMCC No.3915，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还包括制得的石油降解酶制剂在石油降解中的应用。本发明通过将具有降解石油功能的微生物的酶体系通过吸附剂固定后，对受石油污染的土壤进行降解，降解效率显著提高，较微生物降解速度提高30～50倍，稳定性较粗酶液提高15～20倍。