本发明公开了一种两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，以头孢菌素C钠盐浓缩液为底物，采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶，将这两种酶载体按一定的比例混合使头孢菌素C提取液直接转化为D-7-ACA。本发明简化了工艺路线，提高了头孢菌素C发酵组分的利用率，缩短了生产周期，避免了三酶两步法中液氧的使用，提高了生产安全性，且整个过程均采用酶法生产工艺，具有条件温和、设备简单、无污染、收率高、副产物少、成本低等优点，有利于我国绿色制药工业的发展，是一条可持续的工艺路线。