本发明公开了伪雄与全雌尼罗罗非鱼制种方法。步骤如下：1.在尼罗罗非鱼开口后连续投喂含甲基睾丸酮的饲料15天，获得表型全雄罗非鱼并培育至性成熟；2.以上述表型全雄罗非鱼为父本，普通雌性尼罗罗非鱼为母本，采用雌雄1:1建立同胞家系；3.每个家系随机抽取100尾鱼苗进行甲基睾丸酮处理，另外随机取100尾普通饲养作为对照组，统计对照组的雌雄比例，全雌对照组所对应的药物处理组雄鱼为性染色体XX的伪雄罗非鱼，选留伪雄罗非鱼培育到性成熟；4.利用伪雄罗非鱼与普通罗非鱼繁殖的后代性染色体均为XX，普通养殖可实现全雌尼罗罗非鱼规模化制种，甲基睾丸酮处理可批量生产伪雄尼罗罗非鱼。本发明方法能提高罗非鱼种鱼质量，提高制种效率，降低制种成本。